TUNEL 細胞凋亡試劑盒（顯色法），本試劑盒采用TUNEL法，應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細胞斷裂DNA的3´-OH末端催化摻入shen物素。

biotin-TUNEL細胞凋亡試劑盒

貨號：B0068

存儲(chu) 條件：本產(chan) 品應置於(yu) -20℃儲(chu) 存，組分 A、E、G 需避光，避免反複凍融。有效期見外包裝。

注：組分 A、E、F、G 使用時請佩戴口罩、手套，接觸皮膚，請立即用大量水衝(chong) 洗。

產(chan) 品組分：

產(chan) 品簡介：

細胞凋亡的一個(ge) 顯著特點是細胞染色體(ti) DNA 的降解， 這種降解非常特異並有規律，所產(chan) 生的不同長度的DNA片段約為(wei) 180bp-200bp的整數倍，表現為(wei) 瓊脂糖凝膠電泳中呈現特異的梯狀Ladder圖譜，本試劑盒采用TUNEL法，應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細胞斷裂DNA的3´-OH末端催化摻入生wu素（Biotin）標記的dUTP (Biotin-X-dUTP)。隨後和辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的Streptavidin(Streptavidin-HRP) 特異結合， 最後在 HRP 的催化下通過DAB 顯色來顯示凋亡細胞，從(cong) 而可以通過普通光學顯微鏡觀察並計數凋亡細胞。由於(yu) 正常的或正在增值的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有 3´-OH 形成，很少能被染色。TUNEL法可以選擇性的對凋亡細胞直接進行原位檢測，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細胞，是一種更快速、直接的檢測手段。

使用方法：

實驗材料（自備）

PBS 緩衝(chong) 液（pH~7.4）

4%多聚jia醛（PBS 配製）

PBS 配製 0.3% H2O2（新鮮配製）

70%乙醇（自選）

脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）

注意事項：

1. 熒光物質均易發生淬滅，染色後的樣品宜避光保存。

2. 在使用DAPI熒光封片劑的情況下，雖然可減緩淬滅，仍需盡量避光。

3. 為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

實驗步驟

1.樣本準備：

（1）細胞樣品

a. 可選：準備一份陰性對照樣本（加入不含TdT酶的TUNEL反應液）。

b. PBS 清洗細胞兩(liang) 次。

c. 細胞固定：加入適量4%多聚jia醛（pH 7.4）溶液，4℃放置30min。

d. PBS清洗細胞兩(liang) 次。

e. 通透細胞：細胞可用配製於(yu) PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室溫放置 20 min。

f. PBS清洗細胞兩(liang) 次。

g.封閉細胞：每孔加入100μL左右的配製於(yu) PBS中的0.3% H2O2溶液，輕敲孔板使其充分覆蓋細胞，室溫避光封閉30min，用 1×PBS 清洗細胞 2 次；

（2）石蠟組織切片

a.室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次5 min， 以徹di脫掉石蠟。

注：二甲苯有毒，易揮發，請在通風櫥中進行此操作。

b.室溫下，將切片樣本浸沒於(yu) 無水乙醇中漂洗2次，每次5 min。

c.室溫下，將切片樣本連續浸沒在不同濃度梯度的乙醇

（95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂洗1次，每次5 min。

d.室溫下，將切片浸沒於(yu) 純水中漂洗3 min，再將切片浸沒於(yu) 1×PBS中漂洗3 min，用濾紙小心吸幹切片樣本周圍液體(ti) 。

e.用免疫組化筆圍描繪樣品輪廓，以便下遊通透與(yu) 標記。

f.按1: 100的比例，將2mg/mL的蛋白酶K溶液用1×PBS稀釋至終濃度20µg/mL，在每個(ge) 樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區域，室溫孵育20min（蛋白酶K的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優(you) 化）。

注：蛋白酶K可以幫助滲透組織，時間短達不到通透效果， 但延長孵育時間可能導致切片脫落。一般情況下，厚度4µm孵育10min，厚度30µm孵育30min。

g.PBS浸潤清洗切片兩(liang) 次，每次5min。

h.封閉：加入適量配製於(yu) PBS中的0.3% H2O2溶液（新鮮配製），室溫孵育30 min，以滅活切片內(nei) 源的過氧化氫酶。

i.PBS浸潤清洗切片兩(liang) 次，每次 5 min，用濾紙吸去多餘(yu) 的液體(ti) ，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。

（3）冰凍組織切片

a.將冰凍切片放置於(yu) 室溫的片架上，室溫20 min，晾幹。

b.將載玻片浸沒在4%多聚jia醛溶液中，室溫固定30 min。

c.PBS浸潤清洗切片兩(liang) 次，每次5 min。

d.用濾紙小心吸幹載玻片上樣本周圍的液體(ti) 。

e.按1:100的比例，將2 mg/mL 的蛋白酶K溶液用1×PBS 稀釋至終濃度20 µg/mL。每個(ge) 樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區域，室溫孵育10min（Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優(you) 化）。

注：蛋白酶 K 可以幫助滲透組織，時間短達不到通透效果， 但延長孵育時間可能導致切片脫落。一般情況下，厚度4 µm孵育10 min，厚度30 µm 孵育30 min。

f.PBS 浸潤清洗切片兩(liang) 次，每次 5 min。

g.封閉：加入適量配製於(yu) PBS中的0.3% H2O2 溶液（新鮮配製），室溫孵育30 min，以滅活切片內(nei) 源的過氧化氫酶。

h.PBS清洗樣品3次，每次5min，用濾紙吸去多餘(yu) 的液體(ti) ，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。

（4）陽性處理（僅(jin) 陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行TUNEL反應步驟）

a.按1:10的比例用 ddH2O 將10×DNase I Buffer 稀釋成1×DNase I Buffer 備用。

b.滴加100 µL 1×DNase I Buffer 到已通透的樣本上，室溫平衡5 min。

c.用1×DNase I Buffer以1:100稀釋DNase I (2 U/μL)，使其為(wei) 終濃度20 U/mL 的工作液。

d.輕輕吸掉多餘(yu) 液體(ti) ，加入100μL濃度為(wei) 20 U/mL DNase I工作液，室溫孵育10min。

e.輕輕吸掉多餘(yu) 液體(ti) ，PBS 清洗樣品2次。

2.TUNEL 反應

（1）配製TUNEL 反應液（即用即配）：

（2）每個(ge) 樣本加入 50 μL TUNEL 反應液，使反應液均勻覆蓋樣本。37℃孵育 60 min。

注：50μL TUNEL 反應液適合塗片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以適當調整 TUNEL 反應液體(ti) 積，覆蓋細胞即可）。

如果待檢測的樣品為(wei) 塗片、切片或在 24 孔板、12 孔板或 6 孔板中，可以使用防蒸發膜，或自行嚐試使用自封袋或者其它適當材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加 TUNEL 反應液後覆蓋在樣本上，可以防止 TUNEL 反應液蒸發，並且使TUNEL 反應液均勻覆蓋樣本。

（3）棄去 TUNEL 反應液，PBS 清洗 2 次。

3. Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配製

（1）Streptavidin-HRP 工作液的配製（即用即配）：

（2）DAB 顯色液的配製（即用即配）：

4. 樣品顯色

（1）向樣品滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，37℃避光 孵育30 min。

注：50 μL Streptavidin-HRP 工作液適合塗片、切片或 96 孔 板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一個(ge) 孔，如果是 6 孔板， 建議使用 100 μL。為(wei) 防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸發，建議在樣品上覆上防蒸發膜。

（2）PBS清洗樣品3次，每次5min。

（3）向樣品滴加50μL DAB 顯色液，室溫孵育5-30 min或在顯微鏡下根據顏色的發展情況掌握染色時間。 注：如果顯色很強可短於(yu) 5 min 即停止顯色，如果顯色很弱， 可以適當延長顯色時間，甚至顯色過夜。

（4）PBS 清洗樣品3次，每次5 min。

（5）選做：用蘇mu素染色液或甲基綠染色液進行細胞核染色。隨後用PBS清洗 3 次。

（6）直接光學顯微鏡下觀察。針對石蠟切片，如果需要封片，使用95%乙醇脫水5 min，再用100%乙醇脫水2次， 每次3min，再用二甲苯透明2次，每次5min。