【幹貨分享】WB實驗步驟及產品的選擇

【幹貨分享】Western實驗步驟及產(chan) 品選擇

Western blot，也稱Western blotting、Western印跡，常簡寫(xie) 為(wei) WB，是用抗體(ti) 檢測蛋白表達的重要方法之一。WB步驟操作如下：

一、 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

1、裂解液的選擇

根據蛋白在細胞中的位置選擇合適的裂解液，例如RIPA強(R1091)用於(yu) 核蛋白及膜蛋白的提取、RIPA中（R1090）用於(yu) 胞漿蛋白的提取、而RIPA弱或者western專(zhuan) 用裂解液（W0013）適用於(yu) 較好提取的蛋白；

對於(yu) 某些特定的亞(ya) 細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體(ti) 蛋白等，可以參考相關(guan) 文獻提取這些亞(ya) 細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提

2、抑製蛋白降解

為(wei) 防止蛋白的降解，需要添加蛋白酶抑製劑、磷酸酶抑製劑等。例如LABLEAD的蛋白酶抑製劑cocktail（C0101）是一種廣譜型的抑製劑，由六種成分配置成的溶液，可適用於(yu) 蛋白純化，western，IP等各種實驗。

如研究磷酸化蛋白，為(wei) 保持蛋白的穩定，可使用磷酸蛋白酶酶抑製劑（C0104）。

3、蛋白定量：

收集完蛋白樣品後，為(wei) 確保每個(ge) 蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(ge) 蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。不同的蛋白濃度測定方法對於(yu) 一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。

如果使用LABLEAD的裂解液(R1091、R1090、W0013)，可使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(B5001)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(B5106)。

如自己配置裂解液，其中含有triton x-100、SDS等去汙劑時，推薦使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(B5001)；如溶液中含有EDTA、DTT等還原劑時推薦使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒（B5105）

二、電泳(Electrophoresis)

1、SDS-PAGE凝膠配製

SDS-PAGE凝膠分幾種配置的方式，如需自行配置可購買(mai) 製膠液，如30%製膠液（A3291）、4*SDS濃縮膠緩衝(chong) 液（S4880）、4*SDS分離膠緩衝(chong) 液（S4680），也可使用LABLEAD生產(chan) 的SDS-PAGE凝膠配製試劑盒(P1050M)、SDS-PAGE凝膠快速配製試劑盒(P0105)。兩(liang) 種試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配製各種濃度SDS-PAGE的配方。

如需更方便的電泳，可使用LABLEAD的各種濃度規格的預製膠產(chan) 品(P00812/P00815/P01012/P01015/P01212/P01215/P41212/P41215/P42012/P42015)。

2、樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝(chong) 液。例如4X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝(chong) 液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝(chong) 液可以減小上樣體(ti) 積，在相同體(ti) 積的上樣孔內(nei) 可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝(chong) 液可以參考相關(guan) 文獻資料配製，推薦LABLEAD的蛋白上樣緩衝(chong) 液(4X)(G2526)或 蛋白上樣緩衝(chong) 液(5X) (G2527)。

如果是非變性樣品，可以使用非變性非還原性蛋白上樣緩衝(chong) 液(G2621)。

樣品處理時可按照100℃或沸水浴加熱3-5min，或者95℃ 加熱10min，以充分變性蛋白。如使用預製膠，可適當延長樣品處理的時間。

3、上樣與(yu) 電泳

蛋白樣品冷卻到室溫後，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nei) 即可。

LABLEAD提供各種預染蛋白質分子量標準用於(yu) 觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。最好使用彩色預染蛋白質分子量標準(P1017/P1018/P1025/P10310)。

電泳液推薦使用蘭(lan) 博利德生產(chan) 的SDS-PAGE電泳液(T7777)，或者可以長期儲(chu) 存的速溶顆粒產(chan) 品（T7206M）。

電泳時推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，當溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對於(yu) Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀(yi) 就可以滿足要求。為(wei) 了方便起見，也可以采用整個(ge) SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然後設定定時時間為(wei) 90-120分鍾。設置定時可避免發生電泳過頭的情況。

當溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或可根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離後即可停止電泳。

三、 轉膜(Transfer)

推薦在Western實驗中選用PVDF膜，優(you) 先推薦使用PVDF膜，如蛋白分子量大於(yu) 20KD推薦使用(進口分裝，13.25*15cm,0.45μm) (IPVH00010-1)，蛋白分子量小於(yu) 20KD推薦使用(進口分裝，13.25*15cm,0.45μm) (ISEQ00010-1)。PVDF膜在使用前須經甲醇浸潤和活化。也可使用硝酸纖維素膜(NC膜)，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。

轉膜推薦使用bio-rad的預裁轉印濾紙(7.5×10cm) (cat：1703932)，吸水性強，不掉屑。

轉膜溶液推薦使用LABLEAD的10X轉膜緩衝(chong) 液(T3011)，需要在稀釋是添加20%的甲醇，以提高轉膜效率。出於(yu) 安全性、省事性的考慮LABLEAD還有使用乙醇配置的轉膜緩衝(chong) 液，20x快速轉膜緩衝(chong) 液（T3012）

通常濕式轉膜方式，可以設定轉膜電流為(wei) 300-400mA，轉膜時間為(wei) 30-60分鍾。也可以在15-20mA轉膜過夜。具體(ti) 的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。

如使用伯樂(le) 的Turbo係統進行半幹轉時，在使用伯樂(le) 配套的轉膜緩衝(chong) 液（）時，則可參考以下轉膜條件：2.5A恒流，限壓25V，3-5min即可完成轉膜。

在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會(hui) 有非常嚴(yan) 重的發熱現象，最好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。

轉膜的效果可參考所使用的預染蛋白質分子量標準，其中分子量最大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗(li) 春紅染色液對膜進行染色，用於(yu) 觀察實際的轉膜效果。也可用免脫色考馬斯亮藍快速染色液(G1042)對完成轉膜的蛋白膠進行染色，用於(yu) 檢測轉膜的效果。

四、封閉(Blocking)

轉膜結束後，將蛋白膜放置到預先加入了清水的孵育盒（FYH01-1）中，漂洗1-2分鍾，洗去膜上的轉膜液。轉膜結束後的所有步驟，要注意膜的保濕，避免膜的幹燥，否則很容易產(chan) 生較高的背景。

倒掉洗膜後的液體(ti) ，推薦加入適量的快速封閉液(P0203)，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉20-30分鍾；也可以加入用脫脂奶粉（N7861）配置的5%的溶液作為(wei) 封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60分鍾或者4度過夜。對於(yu) 一些背景較高的抗體(ti) ，兩(liang) 種封閉液都可以適當延長封閉時間，如有必要甚至可以4℃封閉過夜。

五、一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說明書(shu) ，按照適當比例用一抗稀釋液(D0151)稀釋一抗。一抗也可以用TBST溶液或者配置好的封閉液稀釋，但是為(wei) 了延長一抗的使用時間，推薦用一抗稀釋液。

收集封閉液，然後加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(ce) 擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜。也可根據抗體(ti) 的說明選擇適當的孵育溫度和時間。

回收一抗。加入TBST緩衝(chong) 液(T9039)洗去未結合的一抗，在側(ce) 擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鍾。吸盡洗滌液後，再加入洗滌液洗滌5-10分鍾。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間並增加洗滌次數。

Western結果通常需要提供內(nei) 參作為(wei) 對照，可以選用Tubulin抗體(ti) (T0100)、Actin抗體(ti) (A0101)或GAPDH抗體(ti) (G0100)，進行內(nei) 參檢測。

六、二抗孵育(Secondary antibody incubation)

參考二抗的說明書(shu) 選擇辣根過氧化物酶(HRP)等標記的二抗。二抗需根據一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如山羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(S0100)。

加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(ce) 擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。

回收二抗，在側(ce) 擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鍾，重複洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間並增加洗滌次數。

七、顯影檢測

使用LABLEAD ECL發光液來檢測蛋白，ECL發光液 普通款（E1050）一般使用暗室曝光時可推薦此款。如需更靈敏的發光液，推薦使用 ECL 超敏發光液（E1060），和 ECL 超敏發光液M（E1070，和millipore WBKLS0100同級別）；如蛋白豐(feng) 度極低時推薦使用 ECL超敏發光液(femto)（E1080）。

八、膜的重複利用

如果蛋白樣品很寶貴，可使用膜再生液(M0500)處理蛋白膜，以重複利用蛋白膜。再次重生使用的膜需要重新封閉後孵育新的二抗。