(N30210-1L)Ni NTA Beads 6FF(鎳填料)

貨號：N30210

存儲(chu) 條件：4-30℃

1、純化流程

1.1 Buffer 的準備

Buffer 可使用下列推薦Buffer，也可根據自己的使用習(xi) 慣配置不同的緩衝(chong) 液體(ti) 係，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer 在使用前最好用0.22μm 或者0.45μm濾膜過濾除菌。因為(wei) Ni NTABeads FF可以用於(yu) 可溶蛋白和包涵體(ti) 蛋白的純化，兩(liang) 種方法所需Buffer 不同，具體(ti) 配置方法見下表：

(N30210-1L)Ni NTA Beads 6FF(鎳填料)可溶性組an酸標簽蛋白純化所需緩衝(chong) 液及配方:

包涵體(ti) 組an酸標簽蛋白純化所需緩衝(chong) 液及配方：

1.2樣品準備

1.2.1細菌或酵母表達的蛋白

1、挑取單菌落到LB 培養(yang) 基中，根據載體(ti) 使用說明加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間。

2、表達結束後，將培養(yang) 液轉移到離心杯中，7,000rpm，離心15min 收集菌體(ti) ，然後加入1/10 體(ti) 積的 Lysis Buffer 和 PMSF，PMSF在破碎前加入，最終濃度為(wei) 1mM。加入溶jun酶（工作濃度為(wei) 0.2-0.4mg/ml，如果表達的宿主細胞內(nei) 含pLysS 或pLysE，可以不加溶jun酶），（同時也可加入其他蛋白酶抑製劑，但不能影響目的蛋白與(yu) 樹脂的結合）。

3、將菌體(ti) 沉澱懸浮起來，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10μg/ml RNase A 和5μg/ml DNase I），混勻，放置於(yu) 冰上，然後冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。

4、將澄清的破碎液轉移至離心管中，10,000rpm 下，4 度離心 20-30 分鍾。取上清，置於(yu) 冰上備用或-20度保存。

1.2.2酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白

1、將細胞培養(yang) 液轉移至離心杯，5000rpm 下，離心10min，收集菌體(ti) 得上清，如上清中不含EDTA、組an酸和還原劑等物質，即可直接加入柱子使用；如含有EDTA、組an酸和還原劑等物質，需用1×PBS 4℃下透析才能加入柱子。

2、對於(yu) 大量體(ti) 積的上清，需加入硫酸氨沉澱濃縮後，蛋白還需用1XPBS 4℃透析後才能加入柱子。

1.2.3包涵體蛋白純化(變性條件)

1、將培養(yang) 液轉移到離心杯中，7,000rpm，離心15min 收集菌體(ti) ，去掉上清。

2、按照菌體(ti) ：Lysis buffer=1:10(W/V)將菌體(ti) 懸浮起來，混勻，冰浴超聲破碎。

3、將破碎液轉移至離心管中，10,000rpm下，4 度離心20-30 分鍾。去掉上清，步驟2）和 3）可以重複一次。

4、按照菌體(ti) :Lysis buffer(含8M 尿素)=1:10(W/V)將包涵體(ti) 懸浮起來。

5、變性條件下進行His 標簽蛋白純化，具體(ti) 緩衝(chong) 液配方見表4。

1.3Ni NTABeads 6FF 的裝填

Ni NTA Beads 6FF 被廣泛應用於(yu) 工業(ye) 純化，因此，涉及到各種中壓色譜層析柱的填裝，下麵介紹使用 Ni NTA Beads 6FF 填裝層析柱的方法。

層析柱的裝填（使用儲液器裝填）

1、用去離子水衝(chong) 洗層析柱底篩板與(yu) 接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關(guan) 閉柱底出口，並在柱底部留出1-2cm 的去離子水。

2、將樹脂懸浮起來，小心的將漿液連續地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chan) 生。

3、如果使用儲(chu) 液器，應立即在層析柱和儲(chu) 液器中加滿水，將進樣分配器放置於(yu) 漿液表麵，連接至泵上，避免在分配器或進樣管中產(chan) 生氣泡。

4、打開層析柱底部出口，開起泵，使其在設定的流速下進行。最初應讓緩衝(chong) 液緩慢流過層析柱，然後緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的衝(chong) 擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達不到推薦的壓力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個(ge) 很好的裝填效果。（注意：在隨後的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%）當柱床高度穩定後，在最後的裝柱流速下至少再上3倍柱床體(ti) 積的去離子水。標上柱床高度。

5、關(guan) 閉泵，關(guan) 閉層析柱出口。

6、如果使用儲(chu) 液器，去除儲(chu) 液器，將分配器至於(yu) 層析柱中。

7、將分配器推向柱子至標記的柱床高度處。允許裝柱液進入分配器，鎖緊分配器接頭。

8、將裝填好的層析柱連接至泵或色譜係統中，開始平衡。如果需要可以重新調整分配器。

1.4樣品純化

Ni NTA Beads 6FF裝填好後，可以用各種常規的中壓色譜係統，以ÄKTA 儀(yi) 器使用為(wei) 例介紹其使用方法。

1、將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜係統中，打開下出口，將預裝柱接到色譜係統中，並旋緊。

2、用3-5 倍柱體(ti) 積的去離子水衝(chong) 洗出儲(chu) 存緩衝(chong) 液。

3、使用至少5 倍柱床體(ti) 積的Lysis Buffer 平衡色譜柱。

4、利用泵或注射器上樣。注：樣品的粘度增加使得即使上樣體(ti) 積很少，也會(hui) 導致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結合能力。大量的樣品體(ti) 積也可能造成很大的反壓，使得進樣器更難使用。

5、用Wash Buffer 衝(chong) 洗柱子，直到紫外吸收達到一個(ge) 穩定的基線（一般至少10-15個(ge) 柱體(ti) 積）。注：在樣品和結合緩衝(chong) 液中加入咪唑可以提高樣品純度。

6、用Elution Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中，通常 5 倍柱體(ti) 積洗脫液就足夠了。可以用一個(ge) 小的梯度，例如 20 倍柱體(ti) 積或更多，來分離不同結合強度的蛋白質。

1.5SDS-PAGE 檢測

將使用純化產(chan) 品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE 檢測純化效果。

2、在位清洗

當填料使用過程中發現反壓過高或者填料上麵出現明顯的汙染時，需要進行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗前，先把 Ni2+脫掉（參見3.填料再生），清洗結束後，將填料保存在 20%乙醇中，後者重新掛鎳再保存在20%乙醇中。建議按照下麵操作去除填料上殘留的汙染物，如沉澱蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過使用30%異丙醇清洗 5-10 個(ge) 柱體(ti) 積，接觸時間為(wei) 15-20分鍾可以去除此類汙染物。然後，再使用 10 倍柱體(ti) 積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去汙劑的酸性或堿性溶液， 清洗填料 2 倍柱體(ti) 積。例如，含有 0.1–0.5% 非離子去汙劑的 0.1 M 醋酸溶液，接觸時間為(wei) 1–2 小時。去汙劑處理後，需要使用70%的乙醇清洗 5 個(ge) 柱體(ti) 積，以徹di去除去汙劑。最後使用10倍柱體(ti) 積的去離子水清洗。

去除離子作用結合的蛋白

使用1.5M NaCl 溶液接觸時間為(wei) 10-15分鍾清洗。然後再使用去離子水清洗10個(ge) 柱體(ti) 積。

3、填料再生

組an酸標簽蛋白親(qin) 和純化填料所帶的鎳離子不需要經常螯合去除和重新掛鎳離子。當填料使用過程中發現反壓過高，填料上麵出現明顯的汙染，或者填料載量明顯變低時，需要進行對填料進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nei) ，按照下麵操作流程進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

3.1使用0.2 M 醋酸溶液（含6 M GuHCl）清洗 2 倍柱體(ti) 積；

3.2使用去離子水清洗5 倍柱體(ti) 積；

3.3使用2% SDS 清洗 3 倍柱體(ti) 積；

3.4使用去離子水清洗5 倍柱體(ti) 積；

3.5使用乙醇清洗5 倍柱體(ti) 積；

3.6使用去離子水清洗5 倍柱體(ti) 積；

3.7使用100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱體(ti) 積；

3.8使用去離子水清洗5 倍柱體(ti) 積；

3.9使用100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱體(ti) 積；

3.10使用去離子水清洗10 倍柱體(ti) 積；

填料再生後，可以立即使用，也可以保存在20%的乙醇中，置於(yu) 4°C 保存。