T4 DNA Ligase (Fast)T4連接酶由攜帶T4噬菌體gene30的大腸杆菌產生。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。

T4 DNA Ligase(Fast)

產(chan) 品貨號：T5205-200U

儲(chu) 存條件：-20℃

產(chan) 品組成

注：1U=1 Weiss unit

產(chan) 品簡介

T4 DNA Ligase(Fast)由攜帶T4噬菌體(ti) gene30的大腸杆菌產(chan) 生。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈DNA、RNA或者DNA/RNA複合物間可修複單鏈缺刻，並且可以連接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但對於(yu) 單鏈核酸無活性，主要用於(yu) 限製性內(nei) 切酶酶切產(chan) 物DNA片段克隆、基因定點突變與(yu) PCR產(chan) 物克隆、修複雙鏈DNA缺刻與(yu) 線性DNA自環化。T4 DNA Ligase(Fast)需要ATP作為(wei) 輔助因子，在室溫下完成粘性末端連接反應僅(jin) 需10分鍾。

酶活單位定義(yi)

37℃條件下，1 Weiss unit的酶在20min內(nei) 催化1nmol的[PPi]轉變為(wei) 活性炭吸附態。1 Weiss unit等同於(yu) 約200個(ge) 粘性末端連接反應單位（CEU），相當於(yu) 在16℃條件下，30min內(nei) 連接50% HindIII消化後的λDNA片段。

酶活檢測條件

酶活在如下反應混合物中進行測試：66mM Tris-HCl(pH7.6)，6.6mM MgCl，0.066mM ATP，10mM DTT，3.3μM[32PPi]。

質量控製

核酸量內(nei) 控切酶製殘留測試

37℃條件下，將200U的T4 DNA Ligase(Fast)與(yu) 1ug的pUC19DNA中溫育4h，未檢測出共價(jia) 閉合環狀DNA轉變為(wei) 帶有缺刻的DNA。

核酸外切酶殘留檢測

將酶液與(yu) 雙鏈DNA底物在37℃溫育16h，通過DNA電泳檢測雙鏈DNA底物無變化。

藍白斑測試

室溫條件下，使用30U T4 DNA Ligase連接pUC57 DNA/HindIII，pUC57 DNA/PstI或pUC57 DNA/SmaI消化產(chan) 物1h，然後用E.coli XL1-Blue感受態細胞轉化連接產(chan) 物，檢測到少於(yu) 1%的白斑。

使用方法

1.DNA插入片段連接至載體(ti) DNA（粘性末端連接）

1）於(yu) 冰上配製如下反應體(ti) 係：

2）充分混勻並瞬離，22℃溫育10min；

3）取1~5ul的連接產(chan) 物用於(yu) 50ul化學感受態細胞的轉化，或者取1~2ul用於(yu) 50ul電轉感受態細胞的轉化。

注：如果連接反應產(chan) 物用於(yu) 電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。

2.DNA插入片段連接至載體(ti) DNA（平末端連接）

1）於(yu) 冰上配製如下反應體(ti) 係：

2）充分混勻並瞬離，22℃溫育1h；

3）取1~5ul的連接產(chan) 物用於(yu) 50ul化學感受態細胞的轉化，或者取1~2ul用於(yu) 50ul電轉感受態細胞的轉化。

注：如果連接反應產(chan) 物用於(yu) 電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。

1. 線性DNA自環化

1）於(yu) 冰上配製如下反應體(ti) 係：

2）徹di混勻並瞬離，22℃溫育10min；

3）取1~5ul的連接產(chan) 物用於(yu) 50ul化學感受態細胞的轉化，或者取1~2ul用於(yu) 50ul電轉感受態細胞的轉化。

注：如果連接反應產(chan) 物用於(yu) 電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。

2.接頭連接

雙鏈寡核苷酸接頭經常被用於(yu) 在插入片段上產(chan) 生粘性末端。接頭通常包含限製酶識別位點，在連接後經酶切處理產(chan) 生和克隆載體(ti) 匹配的粘端。有時候接頭已包含與(yu) 克隆載體(ti) 匹配的粘端，此時無需在接頭連接完成後進行插入片段的進一步處理。

1）於(yu) 冰上配製如下反應體(ti) 係：

2）徹di混勻並瞬離，22℃溫育10min；

3）在65℃作用10min或者70℃作用5min，進行熱失活。

注：添加1mM ATP的條件下，T4 DNA Ligase(Fast)在LabFD™酶切緩衝(chong) 液中具有100%活性。因此，接頭連接反應時可以在LabFD™酶切緩衝(chong) 液中進行，以簡化“接頭連接-酶切"實驗流程。具體(ti) 方法為(wei) ：接頭連接反應完成後，先失活T4 DNA Ligase，然後向該體(ti) 係中添加ATP至終濃度1mM，再在體(ti) 係中加入適量的LabFD™快速內(nei) 切酶，最後使用最適酶切反應溫度進行溫育即可。

注意事項

1）T4 DNA Ligase在濃度高於(yu) 200mM的NaCl或KCl中會(hui) 被強烈抑製；

2）連接反應液添加量不應該超過感受態細胞體(ti) 積的10%，不推薦體(ti) 係中加入過量的T4 DNA Ligase；

3）與(yu) T4 DNA Ligase結合的DNA可能會(hui) 在瓊脂糖凝膠中出現帶移或彌散，為(wei) 了避免此現象，可以在上樣前對酶進行熱失活，必要時加入適量的SDS；

4）聚乙二醇（PEG）能極大地提高平末端連接的連接效率，PEG8000的推薦添加量是連接體(ti) 係的5%（w/v）；

5）電轉化效率可能通過對T4 DNA Ligase熱失活或者使用離心柱或者氯仿抽提純化DNA方式來提高；

6）轉化子數目可通過延長反應時間至1h而增加。