本製品和傳統的T4連接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬間（幾秒鍾-幾min）、高效（接近100%）連接DNA片段的原理采用本公司du創的工藝製成。LabpO TOPO-TA/Blunt通用克隆試劑盒

LabpO TOPO-TA/Blunt通用克隆試劑盒

產(chan) 品貨號：PT0101

儲(chu) 存溫度：－20℃儲(chu) 存，至少12個(ge) 月。冰袋運輸，1-2 天置於(yu) 室外常溫不影響質量。

產(chan) 品介紹

本製品和傳(chuan) 統的T4連接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬間（幾秒鍾-幾min）、高效（接近100%）連接DNA片段的原理采用本公司du創的工藝製成。

（1）可以在瞬間（幾秒鍾-幾min）完成任意PCR產(chan) 物（兼容A末端/平末端）連接。

（2）特製的新型載體(ti) 質粒大小僅(jin) 僅(jin) 不到2kb，充分發揮了TOPO載體(ti) 越小，可容納片段越大的優(you) 勢，最大限度提高了大片段連接效率；連接後質粒大小比傳(chuan) 統載體(ti) 小2kb以上，質粒越小，轉化效率越高，極大的提高了各種片段連接後的轉化子數量。

（3）采用氨苄抗性載體(ti) 隻需10min複蘇時間，比卡那抗性載體(ti) 1小時複蘇時間縮短6倍。

（4）最快可以不用冰浴和熱休克，室溫5min內(nei) 完成轉化；無需1小時複蘇，隻需37℃10 min複蘇便可以塗板。從(cong) 連接到塗板最快隻需15-20min。

（5）zi殺基因零背景原理，無自連假陽性，無需繁瑣藍白斑篩選和菌落PCR篩選。大部分情況下隨機挑一個(ge) 克隆便是有插入的（接近100%）。

（6）連接長片段能力遠超傳(chuan) 統TA/Blunt克隆載體(ti) ，可連接長達10kb片段（例如連接5kb片段，也可能達到挑10個(ge) 菌落，至少8個(ge) 是有插入的效果），是新一代shi界領xian的簡單、快速、零背景免篩選的TOPO TA/Blunt克隆載體(ti) 。

注意：測序隻能采用M13F/M13R通用引物測序（見後麵圖譜），但是不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物測序。菌落 PCR 可使用和測序相同的引物。

操作步驟

1.連接反應的準備：

PCR引物使用正常設計的引物即可，不需做任何改變（不能用磷酸化引物）。任意PCR產(chan) 物（兼容A末端/平末端）均可以直接連接。PCR產(chan) 物一般建議膠回收純化，這樣可以避免後續可能的問題。如果PCR產(chan) 物僅(jin) 有目的條帶、無非特異條帶和引物二聚體(ti) ，也可嚐試直接進行連接反應。如果是以質粒為(wei) 模板的PCR產(chan) 物則最好進行純化，因為(wei) 模板質粒也可能長出菌落（但不是想構建的目的載體(ti) ）。

2.連接反應：

1）室溫（25℃-37℃）設立10ul連接體(ti) 係（建議用0.2ml PCR 管，PCR儀(yi) 器控溫）：

加完試劑後，用移液器輕輕吹打混勻或者輕彈管底混勻，低速瞬時離心收集所有液體(ti) 在離心管底，注意此步驟不能在冰上進行，隻能在室溫（25℃-37℃）進行。

注：如果使用5ul體(ti) 係連接，各成分按照比例減半使用，使用次數可以加倍。不同大小插入片段的推薦用量（注意過量太多了，反而導致轉化子減少）

2）室溫（25℃-37℃）連接5min。

本載體(ti) 推薦室溫（25℃-37℃）5min完成連接。長片段或者連接困難片段可以延長連接時間到10-15min，溫度可選37℃，可顯著增加轉化子數量。

3）連接產(chan) 物置於(yu) 冰上備用。立即接標準的感受態轉化步驟或者快速轉化步驟。

3.快速轉化：

1）感受態細胞從(cong) -80℃拿出，迅速插入冰浴中，解凍融化（約1-3min左右）。

2）立刻加入5ul連接液(最多可全部加入，隻要體(ti) 積不超過感受態細胞體(ti) 積的1/10)， 用手撥da離心管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰浴放置5min。

3）42℃水浴熱激60秒，迅速放回冰浴靜置2-3min，該過程不要搖動離心管。

注意：此步驟shou選建議 42℃水浴 60 秒熱激。但是根據我們(men) 的經驗，大部分商品化的TOP 10 和 DH5a 感受態細胞此步驟也可將離心管置於(yu) 室溫（˃22℃）進行， 時間不需十分準確，夏季或室溫較高時，可放置 5-8min左右；如果室溫較低，可延長時間至8-15min左右。有經驗的客戶可以根據具體(ti) 情況嚐試無熱激轉化。

4）加 300-500ul LB或者SOC培養(yang) 基(不含抗生素)，37℃ 200 rpm 振蕩培養(yang) 10min。

根據經驗，一般可以直接將培養(yang) 基（如從(cong) 冰箱取出溫度低，應事先置37℃溫箱回溫至22℃-37℃）加入到感受態細胞的1.5 ml 離心管，蓋上離心管蓋，水平固定在振蕩培養(yang) 箱中振蕩培養(yang) 複蘇即可，不需要轉移到試管培養(yang) 複蘇。

一般商品化的感受態細胞不超過 2kb 插入片段情況下，熱休克後 10-15 min複蘇可以得到足夠多轉化子，如果使用實驗室自製的感受態效率低、或者轉化子少、插入片段長的情況下可以提高複蘇時間到 30-60 min以得到更多的轉化子。

5）取100-200ul菌液塗板(培養(yang) 板含氨苄qing黴素100ug/ml），培養(yang) 過夜。（如果預計轉化子少，為(wei) 得到較多克隆，4000rpm 離心1min，吸棄掉部分上清，保留100-150ul，輕彈懸浮菌體(ti) ，取全部菌液塗板）

4.轉化子的篩選鑒定：

本製品采用zi殺基因零背景原理，無插入自連的細菌會(hui) zi殺無法生長，因此幾乎沒有假陽性，一般情況下，可以達到所見即所得，隻要是長出來的菌落正常（不是汙染的雜菌，轉化子數量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用菌落PCR 鑒定,直接挑 1-2 個(ge) 菌去測序。

1)一般本公司TOPO 載體(ti) 陽性率非常高，所以菌落生長正常，數量也不是太少的情況下建議省略菌落 PCR/菌液 PCR 鑒定直接去測序。注意測序引物不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物測序。

2) TOPO 載體(ti) 的菌落 PCR 結果容易出現假陰性。因此在使用菌落 PCR 鑒定的情況下，如菌落 PCR 結果陽性，一般可以相信此結果。如結果是陰性，或者顯示擴增出大小和預期不符合，一般不可相信，要考慮到菌落 PCR 結果假陰性的可能。需要進一步提取質粒電泳跑大小，或者酶切鑒定來確認。

用上述培養(yang) 的白色菌落的菌液抽提質粒，插入片段較大的情況下，直接跑電泳看質粒大小就直接能鑒定出有插入的質粒，還可用 EcoR I/Ecor V 單酶切釋放插入片段或用其它合適的酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。

pTOPO-TA/Blunt 載體(ti) 圖譜：

pTOPO-TA/Blunt 載體(ti) 多克隆位點序列：