DNA Assembly Mix Plus，基於重組原理的無縫克隆技術，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術。

DNA Assembly Mix PLUS KIT產(chan) 品貨號：D0204P

儲(chu) 存條件：-20℃

產(chan) 品組分：

DNA Assembly Mix PLUS產(chan) 品簡介：

基於(yu) 重組原理的無縫克隆技術，作為(wei) 新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據DNA片段與(yu) 線性化載體(ti) 末端的15~25nt同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體(ti) 的任意位點，載體(ti) 自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術。

DNA Assembly MixPLUS無縫克隆試劑盒最快僅(jin) 需5分鍾即可完成單片段重組，且陽性率高於(yu) 95%。Mix中添加的輔助因子，有效提高克隆陽性率；經優(you) 化的反應體(ti) 係，能夠一定程度上耐受未純化PCR產(chan) 物中含有的雜質。升級版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率、更好的兼容性。

使用簡單 —— 兼容PCR與(yu) 酶切體(ti) 係，省去繁瑣的純化步驟

超高效率 —— 可以穩定支持5-6片段在同一克隆體(ti) 係

穩定可靠 —— 37℃放置一周或凍融30次，無明顯下降

實驗步驟：

1、實驗流程概要

2、線性化克隆載體(ti) 製備

選擇合適的克隆位點，對載體(ti) 進行線性化，載體(ti) 的線性化可以通過酶切或反向 PCR 擴增完成。

① 酶切製備

推薦使用LabFD™快速內(nei) 切酶進行雙酶切，使載體(ti) 線性化wan 全，以降低轉化背景(假陽性克隆)；若使用單酶切進行線性化，可以適當延長酶切時間以減少環狀質粒殘留。

注1：經雙酶切進行線性化的載體(ti) 無需去磷酸化，經單酶切則需要去磷酸化；

注2：酶切完成後，應將快速內(nei) 切酶失活或對目的產(chan) 物純化後再用於(yu) 重組反應。

② 反向 PCR 擴增製備

為(wei) 減少擴增突變的引入，推薦使用高保真PCR Mix進行擴增。推薦使用預線性化質粒作為(wei) 模板，以減少環狀質粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

3、插入片段PCR引物設計

PCR引物的5' 端必須包含與(yu) 其相鄰片段（插入片段或載體(ti) ）末端同源的15~25 nt（推薦18nt）序列。假如載體(ti) 為(wei) 粘性末端，且3'端突出，則引物設計必須包含突出部分；若5'端突出，則引物設計可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向擴增引物：

5'—上遊載體(ti) 末端同源序列+酶切位點（可選）+ 基因特異性正向擴增序列— 3'

插入片段反向擴增引物：

3'—基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可選）+下遊載體(ti) 末端同源序列—5'

注1：盡量選擇無重複序列且GC含量均勻的區域進行克隆，當載體(ti) 克隆位點上下遊25 nt區域內(nei) GC含量為(wei) 40%~60%時，重組效率zui高；

注2：本試劑盒所提供的 pUC 19 載體(ti) （Ampr）連接端序列如下：

4、插入片段的 PCR 擴增

推薦使用高保真PCR Mix進行擴增，以減少擴增突變的引入。建議使用純化後的PCR產(chan) 物進行無縫克隆反應，若PCR產(chan) 物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定為(wei) 特異性擴增產(chan) 物，可直接使用，但加樣體(ti) 積不應超過總反應體(ti) 積的20%。

5、重組反應

①於(yu) 冰水浴中配置以下反應體(ti) 係：

a.最適載體(ti) 用量(ng)=0.02×載體(ti) 堿基對數，即0.03pmol。

b.插入單片段，最適片段用量（ng）= 0.04×片段堿基對數；

插入多片段，每片段zui適用量（ng）= 0.02×片段堿基對數。

注1：若插入單片段的長度大於(yu) 載體(ti) ，則應互換載體(ti) 與(yu) 插入片段用量；

注2：若插入片段的長度小於(yu) 200 bp，則插入片段應使用5倍載體(ti) 用量；

注3：若按上述公式計算得到的用量超過zui低/zui高值，則建議直接按zui低/最高用量使用；

注4：載體(ti) 片段過長、插入片段過長克隆陽性率均會(hui) 降低。

重組反應體(ti) 係配製完成後，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免產(chan) 生氣泡，切勿渦旋。

② 將反應體(ti) 係置於(yu) 50℃，反應5~60min。

注1：推薦使用 PCR 儀(yi) 等溫控比較精準的儀(yi) 器進行反應，反應時間不足或太長克隆效率均會(hui) 降低；

注2：插入1-2個(ge) 片段時，推薦反應時間5-15min，插入3-5個(ge) 片段時，推薦反應時間15-30min；

注3：當載體(ti) 骨架在 10 kb 以上或插入片段在4 kb以上時，建議延長反應時間到30-60min

注4：50℃反應完成後，建議進行瞬時離心，將反應液收集至管底。

③ 將反應液離心管置於(yu) 冰上冷卻，之後進行轉化或者儲(chu) 存於(yu) -20℃。

注1：-20℃儲(chu) 存的重組產(chan) 物，建議在1周內(nei) 使用。

6、重組產(chan) 物轉化

取5~10μl反應液，加入到100 μl感受態細胞中緩慢吸打混勻，冰上放置30min。42℃熱激45~60sec，冰浴5 min。加500 μl SOC或LB培養(yang) 基，37℃振蕩培養(yang) 40~60min（200 rpm）。將菌液均勻塗布在含有對應抗生素的平板上，倒置於(yu) 37℃過夜培養(yang) 。

注1：不同感受態細胞最後的克隆陽性率會(hui) 有所差別，推薦使用轉化效率>108 CFU/μg的感受態細胞；

注2：菌落數取決(jue) 於(yu) PCR產(chan) 物與(yu) 線性化載體(ti) 的數量和純度；

注3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落，陰性對照平板隻生長很少的菌落。

7、陽性克隆檢測

挑取單菌落至10 μl ddH2O中混勻，95℃裂解10 min 後，取1 μl裂解液作為(wei) 模板，進行菌落PCR鑒定，或將單菌落接種至抗性培養(yang) 基中培養(yang) 過夜後，提取質粒進行酶切鑒定。

注1：菌落 PCR 時建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結果；

注2：必要時可進一步對陽性結果進行測序鑒定。

常見問題：