Glutathione Beads 4FF(GST填料)可以一步純化各種表達係統表達的gu胱甘肽-S-轉移酶、hu胱甘肽依賴性蛋白和gu胱甘肽轉移酶的重組衍生物。 Glutathione Beads 4FF是以高度交聯的4%瓊脂糖凝膠為基質，通過12個原子的間隔臂，用化學方法共價結合了還原型gu胱甘肽製作而成。

Glutathione Beads 4FF（GST填料）

產(chan) 品貨號：G10510

產(chan) 品說明

Glutathione Beads 4FF可以一步純化各種表達係統表達的gu胱甘肽-S-轉移酶、gu胱甘肽依賴性蛋白和gu胱甘肽轉移酶的重組衍生物。 Glutathione Beads 4FF是以高度交聯的4%瓊脂糖凝膠為(wei) 基質，通過12個(ge) 原子的間隔臂，用化學方法共價(jia) 結合了還原型gu胱甘肽製作而 成。Glutathione Beads 4FF因其耐壓的基質，可以在相對較高的流速下，實現對目的蛋白的純化，更適合用於(yu) 工業(ye) 大規模蛋白的純化。

表 1 Glutathione Beads 4FF 產(chan) 品性能

純化流程

1. 緩衝(chong) 液的準備

緩衝(chong) 液在使用前最好用0.22um或者0.45um濾膜過濾。

平衡/洗雜液：140 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4

洗脫液：用平衡液配製10mM還原型gu胱甘肽（現配現用）

注意：平衡液和洗脫液中可加入1-10 mM DTT

2. 樣品準備

樣品在上樣前建議離心或用0.22um或0.45um濾膜過濾，減少雜質，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。

2.1細菌或酵母表達的蛋白

1）挑取單菌落到培養(yang) 基中，根據載體(ti) 使用說明，加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間。

2）表達結束後，將培養(yang) 液轉移到離心杯中，7000 rpm（7500xg）,離心15 min收集菌體(ti) ，然後按照菌體(ti) ：平衡液=1： 10（W/V）加入平衡液，加入終濃度為(wei) 1 mM的PMSF。加入rong菌酶（工作濃度為(wei) 0.2-0.4 mg/ml,如果表達的宿主細胞內(nei) 含pLysS或pLysE，可以不加rong菌酶，同時也可加入其他蛋白酶抑製劑，

但不能影響目的蛋白與(yu) 填料的結合）。

3）將菌體(ti) 沉澱懸浮起來，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNase I）,混勻，放置於(yu) 冰上，然後冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉移至離心管中，10000 rpm（15000xg）, 4°C離心20-30 min。取上清，置於(yu) 冰上備用或-20°C保存。

2.2酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白

1） 將細胞培養(yang) 液轉移至離心杯，5000 rpm（3800xg）,離心10 min,收集菌體(ti) 得上清，即可直接加入柱子使用。

2） 對於(yu) 大量體(ti) 積的上清，需加入硫酸銨沉澱濃縮後，蛋白還需用平衡液透析後才能加入柱子。

3. 層析柱的裝填

3.1重力柱的裝填

1）取合適規格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關(guan) 閉下出口。

2）將Glutathione Beads 4FF混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質實際體(ti) 積占懸液的一半），打開下出口流幹保護液。

3）加入適量純水衝(chong) 洗介質，待柱管中液體(ti) 重力流幹後，關(guan) 閉下出口。

4）裝入潤洗後的上墊片，確保墊片與(yu) 填料之前沒有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡，暫不使用時則加入保護液，2-8°C保存。

3.2中壓層析柱的裝填

裝柱前根據層析柱直徑計算柱子底麵積，根據所需裝柱高度計算所需介質體(ti) 積，公式如下：

V = 1.15πr2h  (V：所需介質體(ti) 積ml；1.15：壓縮係數；r：柱管半徑cm；h：裝填高度cm）

注意：所取懸液體(ti) 積應為(wei) 介質體(ti) 積的兩(liang) 倍，因為(wei) 介質體(ti) 積隻占懸液總體(ti) 積的一半，另一半為(wei) 保護液。

1）用去離子水衝(chong) 洗層析柱底篩板與(yu) 接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關(guan) 閉柱底出口，並在柱底部留1-2 cm的去離子水。

2）將介質懸浮起來，小心的將漿液連續地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chan) 生。

3）如果使用儲(chu) 液器，應立即在層析柱和儲(chu) 液器中加滿水，將進樣分配器放置於(yu) 漿液表麵，連接至泵上，避免在分配器或進樣管中產(chan) 生氣泡。

4）打開層析柱底部出口，開啟泵，使其在設定的流速下進行。最初應讓緩衝(chong) 液緩慢流過層析柱，然後緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的衝(chong) 擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達不到推薦的壓力或流速，可以用所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個(ge) 很好的裝填效果。（注意：在隨後的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%）當柱床高度穩定後，在最後的裝柱流速下至少再上3倍柱床體(ti) 積的去離子水。標上柱床高度。

5）關(guan) 閉泵，關(guan) 閉層析柱出口。

6）如果使用儲(chu) 液器，去除儲(chu) 液器，將分配器置於(yu) 層析柱中。

7）將分配器推向柱子至標記的柱床高度處。允許裝柱液進入分配器，鎖緊分配器接頭。

8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜係統中，開始平衡。如果需要可以重新調整分配器。

4. 樣品純化流程

4.1孵育法純化

1）根據純化樣品量，取適量Glutathione Beads 4FF加入離心管中，1000rpm離心1 min,吸棄上清；也可加入重力柱中，流幹保護液。

2）向離心管中加入5倍介質體(ti) 積的平衡液清洗介質，1000rpm離心1 min,吸棄上清；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流幹平衡液；重複兩(liang) 次以上。

3）加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4°C振蕩孵育2-4h或者37°C孵育30 min-2h。

4）孵育結束後，1000 rpm離心1 min,吸棄上清，或過濾收集介質，上清保留作為(wei) 流穿，用於(yu) 電泳鑒定。

5）用5倍介質體(ti) 積的洗雜液清洗介質，1000 rpm離心1 min或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到介質），重複3-5次，中間建議更換新離心管。

6）加入3-5倍柱體(ti) 積的洗脫液進行洗脫，室溫孵育10-15 min, 1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液，可重複2-3次。

4.2重力柱法純化

1）將裝填好的Glutathione Beads 4FF重力柱用5倍柱體(ti) 積平衡液進行平衡，使填料處於(yu) 與(yu) 目的蛋白相同的緩衝(chong) 液體(ti) 係下，重複2-3次。

2）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時間至少2 min,保證樣品和介質充分接觸，收集流出液，可以反複上樣增加結合效率。

3）用10-15倍柱體(ti) 積的洗雜液進行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4）使用5-10倍柱體(ti) 積的洗脫液洗脫，分段收集，每一個(ge) 柱體(ti) 積收集一管，分別檢測，既可以保證所有結合的目的蛋白被洗脫，又可以得 到高純度和高濃度的蛋白。

4.3中壓層析柱法純化

Glutathione Beads 4FF裝填好後，可以用各種常規的中低壓色譜係統。

1）將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜係統中，打開下出口，將預裝柱接到色譜係統中，並旋緊。

2）用3-5倍柱體(ti) 積的去離子水衝(chong) 洗出儲(chu) 存緩衝(chong) 液。

3）使用至少5倍柱床體(ti) 積的平衡液平衡色譜柱。

4）利用泵或樣品環上樣。

注:樣品的粘度增加使得即使上樣體(ti) 積很少，也會(hui) 導致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結合能力。大量的樣品體(ti) 積也可能造成很大的反壓，使得進樣器更難使用。

5）用洗雜液衝(chong) 洗柱子，直到紫外吸收達到一個(ge) 穩定的基線（一般至少10-15個(ge) 柱體(ti) 積）。

6）使用5-10倍柱體(ti) 積的洗脫液洗脫，收集洗脫液，即目的蛋白組分。

上述步驟洗脫結束後，用平衡液衝(chong) 洗3倍柱體(ti) 積，然後用純水衝(chong) 洗5倍柱體(ti) 積，再用保護液衝(chong) 洗2個(ge) 柱體(ti) 積，然後將介質置於(yu) 2-8°C保存。

5. SDS-PAGE 檢測

將使用純化產(chan) 品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。

6. 填料清洗

GST標簽蛋白純化產(chan) 品可以重複使用而無需再生，但隨著非特異性結合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和結合載量性能下降, 這時需要對填料進行清洗。

去除一些沉澱或變性物質，建議使用下麵的方法

用2倍柱體(ti) 積的6 M鹽酸胍溶液進行清洗，然後立即用5倍柱體(ti) 積的PBS, pH 7.4清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質

用3-4倍柱體(ti) 積的70%乙醇或2倍柱體(ti) 積的1% Triton X-100清洗，然後立即用5倍柱體(ti) 積的PBS, pH 7.4清洗。