磷脂酰si氨酸（PS）是一種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS隻分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜 PS由脂膜內側翻向細胞膜外側，使PS暴露在細胞膜外表麵。
Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒

Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

貨    號：AF2020

保存溫度：4℃

產(chan) 品介紹：

磷脂酰si氨酸（PS）是一種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS隻分布在細胞膜脂質雙層的內(nei) 側(ce) ，而在細胞凋亡早期，細胞膜 PS由脂膜內(nei) 側(ce) 翻向細胞膜外側(ce) ，使PS暴露在細胞膜外表麵。Annexin V是一種分子量為(wei) 35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋⽩，與(yu) 磷脂酰si氨酸有⾼度親(qin) 和⼒，故可通過細胞外側(ce) 暴露的磷脂酰si氨酸與(yu) 凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被公ren為(wei) 檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。

本產(chan) 品將Annexin V進行綠色熒光（FITC）標記，以標記了的Annexin V作為(wei) 探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀(yi) 可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此采用Annexin V與(yu) PI雙染的方法，就可以將處於(yu) 不同凋亡時期的細胞區分開來。

試劑盒組份：

所需實驗器材： 微量移液器：PBS；不含 EDTA 的yi酶消化液；低速離心機；流式細胞儀(yi)

注意事項：

1. 此試劑盒僅(jin) 供研究使用。

2. 微量試劑需離心數秒將試劑收集⾄管底後再開蓋取用。

3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作時要帶手套，使用時避免與(yu) 皮膚，眼睛和黏膜接觸。

4. Annexin V-FITC 中含有ju毒成分疊dan化na（NaN3）, 操作時要帶手套，使用時避免與(yu) 皮膚，眼睛和黏膜接觸。

5. 本試劑盒用於(yu) 檢測活細胞，流式細胞儀(yi) 檢測時，細胞數量不應低於(yu) 1x106。

6. 染色後宜盡快檢測，時間過長可能會(hui) 導致凋亡或壞死細胞的數量增加。

7. Annixin V 檢測凋亡細胞的方法適用於(yu) 懸浮生長的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對於(yu) 貼壁生長的細胞，由於(yu) 在yi酶等消化處理過程中會(hui) 造成細胞膜的損傷(shang) ，會(hui) 造成較⾼的假陽性，而用細胞刮子會(hui) 造成細胞粘連成團，而影響檢測，可將yi酶消化後的細胞保存在含 2%BSA 的 PBS 中，防⽌進一步的損傷(shang) 。盡管⽬前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細胞。不推薦用該方法檢測。因為(wei) 其重複性較差，且需要操作時非常小心。

8. 消化貼壁細胞殘留的yi酶會(hui) 消化並降解 Annexin V-FITC，最終導致染色失敗。

9. 細胞固定後可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

操作說明：

1. 細胞樣品的準備：

(a) 懸浮細胞：

(1）收集細胞⾄離心管中 1000-2000rpm 離心 5min，小心去除上清。

(2）用 1ml 4℃預冷 PBS 輕輕重懸細胞並計數，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。

(3）再加入 1ml 4℃預冷的 PBS 重懸細胞，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。

(b) 貼壁細胞：

(1）吸出細胞培養(yang) 液⾄離心管中，PBS 洗滌貼壁細胞一次，加入適量不含 EDTA 的yi酶細胞消化液消化細胞。

(2）室溫孵育⾄輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除yi酶細胞消化液。需避免yi酶的過度消化。

(3）加入以上步驟中收集的細胞培養(yang) 液，稍混勻，轉移到離心管內(nei) ，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。

注：加入的細胞培養(yang) 液一方麵可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞，另一方麵細胞培養(yang) 液中的⾎清可以有效抑製或中和殘留的yi酶；殘留的yi酶會(hui) 消化並降解後續加入的 Annexin V-FITC 導致染色失敗。

(4）用 1ml 4℃預冷 PBS 輕輕重懸細胞並計數，1000-2000rpm 離心5min，小心吸除上清。

(5）再加入 1ml 4℃預冷的 PBS 重懸細胞，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。

2. 用去離子水按 1：4 稀釋 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去離子水）；

3. 用 250µl 結合緩衝(chong) 液重新懸浮細胞，調節其濃度為(wei) 1×106/ml；

4. 取100µl的細胞懸液於(yu) 5 ml流式管中，加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻；

5. 室溫(20-25℃)避光孵育10min；

6. 上機前 5min 加入10ul碘化丙啶溶液，輕輕混勻；

7. 上機前在反應管中補加 400µl PBS 重懸細胞， 避光保存，隨即進行流式細胞儀(yi) （FACS）檢測， Annexin V-FITC 為(wei) 綠色熒光，PI為(wei) 紅色熒光。