RFP-Nanoab-Agarose
偶聯anti-RFP納米抗體的瓊脂糖珠子用於免疫沉澱RFP融合蛋白。

RFP-Nanoab-Agarose

貨號：RNA-25-500

儲(chu) 存條件：可在4℃保存1年(確保wan全密封)，或在-80℃長期保存，避免反複凍融。

產(chan) 品描述

偶聯anti-RFP納米抗體(ti) 的瓊脂糖珠子用於(yu) 免疫沉澱RFP融合蛋白。

產(chan) 品優(you) 勢

沒有普通抗體(ti) 的輕鏈和重鏈，背景幹淨；

即用型，節約時間；

高親(qin) 和力，高載量。

應用範圍

可用於(yu) 免疫沉澱（IP）/免疫共沉澱（CoIP）、染色質免疫沉澱（ChIP）/RNA結合蛋白免疫沉澱（RIP）、酶活性測定、質譜分析等。

特異性

特異性結合mCherry，RFP及 DsRed。

產(chan) 品特性

存儲(chu) 緩衝(chong) 液：PBS(含有20%乙醇)。

保存條件：可在4℃保存1年(確保wan全密封)，或在-80℃長期保存，避免反複凍融。

實驗原理

實驗步驟：

收集細胞
每個(ge) 免疫沉澱反應大約使用 10⁶-10⁷ 個(ge) 表達RFP融合蛋白的細胞，可根據RFP融合蛋白表達量適當調整細胞數。

吸出培養(yang) 基，向培養(yang) 皿中加入預冷的1×PBS，漂洗2次，利用細胞刮或yi酶消化收集貼壁細胞，細胞轉移到離心管，500g離心3分鍾並丟(diu) 棄上清液。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置於(yu) 冷凍液氮中，之後將冷凍後得植物組織樣本放於(yu) 研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑製劑 PMSF 等）進行裂解，為(wei) 了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成後 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉澱。

細胞裂解

1．在裂解緩衝(chong) 液中加入蛋白酶抑製劑，用500μl預冷的裂解緩衝(chong) 液重懸細胞。

2．置於(yu) 冰上30分鍾，可每10分鍾充分吹打一次。

3．4℃，20,000g離心15分鍾，將裂解產(chan) 物（上清）轉移到一個(ge) 新的預冷管中，丟(diu) 棄沉澱。注意：此時細胞裂解產(chan) 物可長期保存於(yu) -80℃。

結合蛋白
4．將平衡好的RFP-Nanoab-Agarose加入到細胞裂解產(chan) 物中（可在細胞裂解產(chan) 物中直接加入20μl該產(chan) 品），於(yu) 4℃旋轉混合結合1小時。根據實驗需要可調整結合時間。如果需要，留存50μl的裂解產(chan) 物進行免疫印跡分析。
5．4℃，2,500g離心30秒，丟(diu) 棄上清液。如果需要，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。
清洗珠子
6．用500μl預冷的裂解緩衝(chong) 液中重懸5中的RFP-Nanoab-Agarose，4℃，2,500g條件下離心30秒，丟(diu) 棄上清液並重複清洗3次。盡量減少清洗時間。
洗脫蛋白
方法一：
7．加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸RFP-Nanoab-Agarose。95℃，加熱10min充分變性，2,500g離心30秒收集上清，收集的產(chan) 物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二：
8．加入50μl 0.2 M pH2.5的gan氨酸洗脫結合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，2,500g離心30秒收集上清，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）以中和酸性的gan氨酸。注意：為(wei) 了提高洗脫效率可以重複這一步。

可選實驗方案
方案一：
如需進行RFP融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測。
方案二：
如需進行染色質免疫沉澱（ChIP）實驗，主要用於(yu) 含有RFP融合蛋白的蛋白質/DNA相互作用的實驗。染色質免疫沉澱一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉澱，聯反應的逆轉，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定，染色質斷裂不變；然後接著直接進入說明書(shu) 的第4步，加入細胞裂解產(chan) 物後，DNA-蛋白質複合物結合到RFP-Nanoab-Agarose上；
進入第5和6步，分離得到複合物；進入第8步，得到洗脫的複合物；後期交聯反應的逆轉，DNA的純化及DNA的鑒定等同於(yu) 普通的ChIP實驗。RNA結合蛋白免疫沉澱（RIP）實驗步驟同上。
方案三：
RFP-Nanoab-Agarose 不僅(jin) 可以用於(yu) 在體(ti) 內(nei) 外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用，也可以結合質譜分析篩選與(yu) 已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉澱法，得到洗脫的複合物後，然後進行SDS–PAGE分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色後，切下未知蛋白的條帶，用質譜技術鑒定未知蛋白。