偶聯 anti-GFP 納米抗體的磁性納米微球用於免疫沉澱 GFP 融合蛋白。GFP-Nanoab-Magnetic Beads

GFP-Nanoab-Magnetic Beads

貨號：GNM-50-2000

儲(chu) 存條件：可在 4℃保存半年，避免離心，幹燥，長時間保存可凍存。

產(chan) 品描述

偶聯 anti-GFP 納米抗體(ti) 的磁性納米微球用於(yu) 免疫沉澱 GFP 融合蛋白。

產(chan) 品優(you) 勢

沒有普通抗體(ti) 的輕鏈和重鏈；

高親(qin) 和力：解離常數達到 pM 級別；

高載量：20μl 的 slurry 可以結合 8-10μg GFP 蛋白；

較短的孵育時間，結合 5-30 min 即可；

應用範圍

可用於(yu) 免疫沉澱（IP）/免疫共沉澱（CoIP）、染色質免疫沉澱（ChIP）/RNA 結合蛋白免疫沉澱（RIP）、酶活性測定、質譜分析等；

特異性

可以結合 GFP、EGFP、YFP 和 EYFP 等。

產(chan) 品特性

保存條件：可在 4℃保存半年，避免離心，幹燥，長時間保存可凍存。

存儲(chu) 緩衝(chong) 液：PBS(含有 20%乙醇)。

實驗步驟：

收集細胞：

每個(ge) 免疫沉澱反應大約使用 10⁶-10⁷ 的哺乳動物細胞（約一個(ge) 10 cm培養(yang) 皿）表達綠色熒光蛋白融合蛋白。吸出生長培養(yang) 基、向培養(yang) 皿中加入 2ml預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次，利用細胞刮或yi酶消化的方法收集貼壁細胞，細胞轉移到離心管，500 g離心 3 分鍾並丟(diu) 棄上清液。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置於(yu) 冷凍液氮中，之後將冷凍後得植物組織樣本放於(yu) 研缽進行研磨，盡 可能充分研磨破壞其細胞壁。加入 500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑製劑 PMSF 等）進行裂解，為(wei) 了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成後 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉澱。

細胞裂解：

1．用500μl 預冷的裂解緩衝(chong) 液重懸細胞，在裂解緩衝(chong) 液中加入蛋白酶抑製劑與(yu) 1 mM PMSF（自備）。對於(yu) 核/染色質蛋白可使用 RIPA 裂解液中加入1 mg/ml DNase, 2.5 mM MgCl2，蛋白酶抑製劑與(yu) 1 mM PMSF（自備）。

2．把離心管放置在冰上 30 分鍾，可以每 10 分鍾充分吹打一次。

3．細胞裂解產(chan) 物在 4℃，20,000 g 條件下離心 15 分鍾，轉移裂解產(chan) 物到一個(ge) 新的預冷管中，丟(diu) 棄沉澱。注意：此時細胞裂解產(chan) 物可以放在-80℃進行長期儲(chu) 存。

平衡珠子：

4．振蕩混勻 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，吸取 40μl slurry 到 500 μl 預冷的裂解緩衝(chong) 液中，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態，丟(diu) 棄上清液。（此步驟可選）

結合蛋白

5．將細胞裂解產(chan) 物加入到平衡的 GFP-Nanoab-Magnetic Beads 中（如果未做第 4 步，可在細胞裂解產(chan) 物中直接加入40μl slurry），在 4 ℃冷櫃中的旋轉混合儀(yi) 上結合 30-60 min。如果需要，保存 50 μl 的裂解產(chan) 物進行免疫印跡分析。

6. 在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態，丟(diu) 棄上清液。如果需要，保存 50 μl 上清液進行免疫印跡分析。

清洗珠子：

7. 用 500 μl 預冷的裂解緩衝(chong) 液中重懸 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態，丟(diu) 棄上清液並重複洗滌 2 次。（可選：在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM）。

洗脫蛋白：

方法一：

加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重懸 GFP-Nanoab-Magnetic Beads。

在 95℃，10 min 條件下，加熱 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，把免疫沉澱複合物從(cong) 珠子上遊離出來。GFP-Nanoab-Magnetic Beads 可在磁力架上進行分離，收集的產(chan) 物可以進行 SDS–PAGE 分析。

方法二：

替代步驟 8 和 9 的可選步驟：加入 50μl 0.2 M pH2.5 的gan氨酸洗脫結合的蛋白，建議孵育時間 30 秒，並不斷混勻，隨後用磁力架進行分離，轉移上清液到新管中，為(wei) 了中和酸性的gan氨酸，需添加 5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：為(wei) 了提高洗脫效率可以重複這一步。

可選方案

方案一：

如需進行 GFP 融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測。

方案二：

如需進行染色質免疫沉澱（ChIP） 實驗，主要用於(yu) 含有 GFP 融合蛋白的蛋白質/DNA 相互作用的實驗。染色質免疫沉澱一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉澱，交聯反應的逆轉，DNA 的純化以及 DNA 的鑒定。其中前期細胞固定，染色質斷裂不變；然後接著直接進入說明書(shu) 的第 5 步，加入細胞裂解產(chan) 物後，DNA-蛋白質複合物結合到 GFP-Nanoab-Magnetic Beads上；進入第 6 和 7 步，分離得到複合物；進入第 10 步，得到洗脫的複合物；後期交聯反應的逆轉，DNA 的純化及 DNA 的鑒定等同於(yu) 普通的 ChIP 實驗。RNA 結合蛋白免疫沉澱（RIP）實驗步驟同上。

方案三：

GFP-Nanoab-Magnetic Beads 不僅(jin) 可以用於(yu) 在體(ti) 內(nei) 外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用，也可以結合質譜分析篩選與(yu) 已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉澱法，得到洗脫的複合物後，然後進行 SDS–PAGE 分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色後，切下未知蛋白的條帶，用質譜技術鑒定未知蛋白。