偶聯anti-RFP-tag納米抗體的磁性納米微球用於免疫沉澱RFP-tag融合蛋白。RFP-Nanoab-Magnetic Beads

RFP-Nanoab-Magnetic Beads

貨號：RNM-25-1000

儲(chu) 存條件：可在4℃保存1年(確保完quan密封)，避免離心，幹燥和凍融。

產(chan) 品描述

偶聯anti-RFP-tag納米抗體(ti) 的磁性納米微球用於(yu) 免疫沉澱RFP-tag融合蛋白。

產(chan) 品優(you) 勢

沒有普通抗體(ti) 的輕鏈和重鏈，背景幹淨；

即用型，節約時間；

高親(qin) 和力，高載量。

應用範圍

可用於(yu) 免疫沉澱（IP）/免疫共沉澱（CoIP）、染色質免疫沉澱（ChIP）/RNA結合蛋白免疫沉澱（RIP）、酶活性測定、質譜分析等。

特異性

特異性結合位於(yu) 融合蛋白N-端、C-端及內(nei) 部的RFP-tag。

產(chan) 品特性

存儲(chu) 緩衝(chong) 液：PBS(含有20%乙醇)。

保存條件：可在4℃保存1年(確保完quan密封)，避免離心，幹燥和凍融。

實驗原理

實驗步驟：

收集細胞
   每個(ge) 免疫沉澱反應大約使用 10⁶-10⁷ 個(ge) 表達RFP-tag融合蛋白的細胞，可根據RFP-tag融合蛋白表達量適當調整細胞數。吸出培養(yang) 基，向培養(yang) 皿中加入預冷的1×PBS，漂洗2次，利用細胞刮或yi酶消化收集貼壁細胞，細胞轉移到離心管，500g離心3分鍾並丟(diu) 棄上清液

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置於(yu) 冷凍液氮中，之後將冷凍後得植物組織樣本放於(yu) 研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑製劑 PMSF 等）進行裂解，為(wei) 了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成後 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉澱。

細胞裂解

1. 在裂解緩衝(chong) 液中加入蛋白酶抑製劑，用500μl預冷的裂解緩衝(chong) 液重懸細胞。

2. 置於(yu) 冰上30分鍾，可每10分鍾充分吹打一次。

3. 4℃，20,000g離心15分鍾，將裂解產(chan) 物（上清）轉移到一個(ge) 新的預冷管中，丟(diu) 棄沉澱。

注意：此時細胞裂解產(chan) 物可長期保存於(yu) -80℃。

結合蛋白

4. 將平衡好的RFP-Nanoab-Magnetic Beads加入到細胞裂解產(chan) 物中（可在細胞裂解產(chan) 物中直接加入40μl該產(chan) 品），於(yu) 4℃旋轉混合結合1小時。根據實驗需要可調整結合時間。如果需要，留存50μl的裂解產(chan) 物進行免疫印跡分析。

5. 在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態，丟(diu) 棄上清液。如果需要，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。

清洗珠子

6. 用500μl預冷的裂解緩衝(chong) 液中重懸5中的RFP-Nanoab-Magnetic Beads，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態，丟(diu) 棄上清液並重複清洗3次。盡量減少清洗時間。

洗脫蛋白

方法一：

7. 加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸RFP-Nanoab-Magnetic Beads。95℃，加熱10min充分變性，在磁力架上進行分離，收集的產(chan) 物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二：

8. 加入50μl 0.2 M pH2.5的gan氨酸洗脫結合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，在磁力架上進行分離並收集上清，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）以中和酸性的gan氨酸。注意：為(wei) 了提高洗脫效率可以重複這一步。

方法三：

9. 加入40µM RFP-peptide進行洗脫。

可選實驗方案

方案一：
如需進行RFP融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測。
方案二：
如需進行染色質免疫沉澱（ChIP）實驗，主要用於(yu) 含有RFP融合蛋白的蛋白質/DNA相互作用的實驗。染色質免疫沉澱一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉澱，聯反應的逆轉，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定，染色質斷裂不變；然後接著直接進入說明書(shu) 的第4步，加入細胞裂解產(chan) 物後，DNA-蛋白質複合物結合到RFP-Nanoab-Magnetic Beads上；

進入第5和6步，分離得到複合物；進入第8步，得到洗脫的複合物；後期交聯反應的逆轉，DNA的純化及DNA的鑒定等同於(yu) 普通的ChIP實驗。RNA結合蛋白免疫沉澱（RIP）實驗步驟同上。
方案三：
RFP-Nanoab-Magnetic Beads不僅(jin) 可以用於(yu) 在體(ti) 內(nei) 外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用，也可以結合質譜分析篩選與(yu) 已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉澱法，得到洗脫的複合物後，然後進行SDS–PAGE分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色後，切下未知蛋白的條帶，用質譜技術鑒定未知蛋白。