線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)是一種以 JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用於早期的細胞凋亡檢測，也是用來檢測細胞早期凋亡的常用方法。

線粒體(ti) 膜電位檢測試劑盒(JC-1)

產(chan) 品貨號：J22202

儲(chu) 存條件： -20℃避光保存，並盡量避免反複凍融。超純水和 JC-1染色緩衝(chong) 液(5X)也可 4℃保存。

產(chan) 品描述：

JC-1線粒體(ti) 膜電位檢測試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以 JC-1為(wei) 熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體(ti) 膜電位變化的試劑盒，可以用於(yu) 早期的細胞凋亡檢測，也是用來檢測細胞早期凋亡的常用方法。

JC-1是一種廣泛用於(yu) 檢測線粒體(ti) 膜電位△Ψm的理想熒光探針，JC-1染料以電勢依賴性的方式積聚在線粒體(ti) 內(nei) 。正常線粒體(ti) 內(nei) ，JC-1聚集在線粒體(ti) 基質中形成聚合物，聚合物發出強烈的紅色熒光（Ex=585nm, Em=590nm）；不健康的線粒體(ti) 由於(yu) 膜電位的下降或喪(sang) 失，JC-1隻能以單體(ti) 的形式存在於(yu) 胞漿中，產(chan) 生綠色熒光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1 不僅(jin) 可用於(yu) 定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體(ti) 膜電位的變化。也可以用於(yu) 定量檢測，因線粒體(ti) 的去極化程度可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。觀察時，隻需使用常規的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。

線粒體(ti) 膜電勢的破壞是細胞凋亡早期發生的一個(ge) 標誌性事件。細胞受到凋亡誘導後線粒體(ti) 膜電位的變化使得膜的通透性發生改變。膜通透性的增加，使得線粒體(ti) 蛋白包括細胞se素C、Smac/DIABLO、HtrA2/OMI、核酸內(nei) 切酶G（EndoG）、凋亡誘導因子（AIF）等從(cong) 線粒體(ti) 基質釋放到細胞漿。細胞se素C的釋放伴隨膜電位的*喪(sang) 失，進而引發細胞凋亡酶的級聯效應。

本試劑盒提供了CCCP作為(wei) 誘導線粒體(ti) 膜電位下降的陽性對照。對於(yu) 六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100個(ge) 樣品；對於(yu) 12孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測200個(ge) 樣品。

使用說明：

1. JC-1染色工作液的配製

六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為(wei) 1 mL，其他培養(yang) 器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推；對於(yu) 細胞懸液每 50～100 萬(wan) 細胞需 0.5 mL JC-1 染色工作液。取適量 JC-1（200x），按照每 50μL JC-1（200x）加入8 mL超純水的比例稀釋 JC-1。劇烈震蕩充分溶解並混勻 JC-1。然後再加入2 mL JC-1 染色緩衝(chong) 液（5x），混勻後即為(wei) JC-1  染色工作液。

2. 陽性對照的設置

把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照 1：1000的比例加入到細胞培養(yang) 液中， 稀釋至 10uM，處理細胞20分鍾。隨後按照下述方法裝載 JC-1，進行線粒體(ti) 膜電位的檢測。對於(yu) 大多數細胞，通常10uM CCCP 處理20分鍾後線粒體(ti) 的膜電位會(hui) *喪(sang) 失，JC-1染色後觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經JC-1染色後應顯示紅色熒光。對於(yu) 特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guan) 文獻資料決(jue) 定或優(you) 化體(ti) 係摸索最you條件。

3.對於(yu) 懸浮細胞

1）取10～60萬(wan) 細胞，重懸於(yu) 0.5 mL 細胞培養(yang) 液中，細胞培養(yang) 液中可以含血清和酚紅。

2）加入 0.5 mL JC-1 染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養(yang) 箱中 37℃孵育 20 分鍾。

3）在孵育期間，按照每 1 mL JC-1 染色緩衝(chong) 液（5x）加入 4 mL 蒸餾水的比例，配製適量的 JC-1  染色緩衝(chong) 液（1x），並放置於(yu) 冰浴。

4）37℃孵育結束後，600x g 4℃離心3～4分鍾，沉澱細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

5）用JC-1染色緩衝(chong) 液（1x）洗滌 2 次：加入 1 mL JC-1染色緩衝(chong) 液（1x）重懸細胞，600xg 4℃離心3～4分鍾，沉澱細胞，棄上清。再加入 1 mL JC-1染色緩衝(chong) 液（1x）重懸細胞，600xg 4℃離心3～4分鍾，沉澱細胞，棄上清。

6）再用適量 JC-1 染色緩衝(chong) 液（1x）重懸後，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀(yi) 分析。

4.對於(yu) 貼壁細胞

對於(yu) 貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀(yi) 檢測，可以先收集細胞，重懸後參考懸浮細胞的檢測方法。

1）對於(yu) 六孔板的一個(ge) 孔，吸除培養(yang) 液，根據具體(ti) 實驗如有必要可以用 PBS 或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1mL細胞培養(yang) 液。細胞培養(yang) 液中可以含有血清和酚紅。

2）加入 1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養(yang) 箱中37℃孵育20分鍾。

3）在孵育期間，按照每 1 mL JC-1 染色緩衝(chong) 液（5x）加入4 mL蒸餾水的比例，配製適量的JC-1染色緩衝(chong) 液（1x），並放置於(yu) 冰浴。

4）37℃孵育結束後，吸除上清，用JC-1染色緩衝(chong) 液（1x）洗滌2次。

5）加入2 mL細胞培養(yang) 液，培養(yang) 液中可以含有血清和酚紅。

6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5.對於(yu) 純化的線粒體(ti)

1）把配製好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 染色緩衝(chong) 液（1x）稀釋 5 倍。

2）0.9 mL 5 倍稀釋的JC-1染色工作液中加入 0.1 mL 總蛋白量為(wei) 10～100ug 純化的線粒體(ti) 。

3）用熒光分光光度計或熒光酶標儀(yi) 檢測：混勻後直接用熒光分光光度計進行時間掃描（time scan），激發波長為(wei) 485 nm，發射波長為(wei) 590 nm。如果使用熒光酶標儀(yi) ，激發波長不能設置

為(wei) 485 nm 時，可以在 475～520 nm 範圍內(nei) 設置激發波長。另外，也可以參考下麵步驟6中的波長設置進行熒光檢測。

4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下麵的步驟6。

6.熒光觀測和結果分析

檢測 JC-1 單體(ti) 時可以把激發光設置為(wei) 490 nm，發射光設置為(wei) 530 nm；

檢測 JC-1 聚合物時，可以把激發光設置為(wei) 525 nm，發射光設置為(wei) 590 nm。

注意：

此處測定熒光時不必把激發光和發射光設置在最da激發波長和最da發射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-1 聚合物時可使用常來檢測碘化丙啶或者 Cy3 用的標準帶通濾波器。檢測 JC-1 單體(ti) 可使用常來檢測綠色熒光化合物如 FITC 的標準帶通濾波器。出現綠色熒光說明線粒體(ti) 膜電位下降，並且該細胞很可能處於(yu) 細胞凋亡早期。出現紅色熒光說明線粒體(ti) 膜電位比較正常，細胞的狀態也比較正常。

注意事項：

1.JC-1（200x）在 4℃、冰浴等較低溫度情況下會(hui) 凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nei) ， 可以 20～25℃水浴溫育片刻至全部融解後使用。

2.必須先把 JC-1（200x）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻後，才可以加入 JC-1 染色緩衝(chong) 液（5x）。不可先配製 JC-1 染色緩衝(chong) 液（1x）再加入 JC-1（200x），這樣 JC-1 會(hui) 很難充分溶解，會(hui) 嚴(yan) 重影響後續的檢測。

3.裝載完 JC-1 後用 JC-1 染色緩衝(chong) 液（1x）洗滌時，使 JC-1 染色緩衝(chong) 液（1x）保持 4℃左右，此時的洗滌效果較好。

4.JC-1 探針裝載完並洗滌後盡量在 30 分鍾內(nei) 完成後續檢測。在檢測前需冰浴保存。

5.請勿把 JC-1 染色緩衝(chong) 液（5x）全部配製成 JC-1 染色緩衝(chong) 液（1x），本試劑盒使用過程中需直接使用 JC-1 染色緩衝(chong) 液（5x）。

6.如果發現 JC-1 染色緩衝(chong) 液（5x）中有沉澱，必須全部溶解後才能使用，為(wei) 促進溶解可以在 37℃加熱。

7.CCCP 為(wei) 線粒體(ti) 電子傳(chuan) 遞鏈抑製劑，有毒，請注意小心防護。

8.為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。本品僅(jin) 用於(yu) 實驗研究。

產(chan) 品組成：